作者:佚名 来源:本站原创 点击数: 更新时间:2008年08月11日【字体：大 中 小】
【摘要】目的探讨免疫抑制剂普乐可复(FK506)对于异种小肠移植后迟发异种移植物排斥反应和细胞介导的异种移植物排斥反应的作用。方法采用仓鼠．大鼠动物实验模型，分为对照组和治疗组。治疗1组为单纯用FKS06组；治疗2组为普乐可复(FK506)加脾切除组。观察移植肠管吸收功能、体重、生存时间、普乐可复(FK506)血药浓度及移植肠管苏木精．伊红染色。结果治疗1、2组的生存时间分别为(29．5±2．4)d和(106．6±26．3)d，与对照组(4．3±0．5)d相比显著延长(P<0．01)；且治疗1、2组之间相比，差异亦有非常显著性意义(P=0．006)。术后第4d对照组苏木精．伊红染色可见绒毛萎缩，有大量炎性细胞浸润。治疗组小肠黏膜显示高分泌状态。术后126d治疗2组小肠肌层明显增厚、绒毛萎缩、肠壁小动脉壁纤维化。结论普乐可复(FK506)可抑制异种小肠移植后迟发异种移植物排斥反应和细胞介导的异种移植物排斥反应；加脾切除可明显延长异种小肠移植的存活时间；但不能逆转异种小肠移植后所发生的慢性排斥反应。
小肠移植是治疗短肠综合征的有效方法，但也与其他器官移植一样面临着供体短缺现象，为解决供体不足，我们以仓鼠．大鼠异种小肠移植动物实验模型，观察移植后生存时间、体重变化、普乐可复(FK506)血药浓度、移植肠管血糖吸收值，并定时采取移植肠基金项目：中国博士后科学基金(1999年度)；哈尔滨市科学技术委员会归国人员基金(9881218oo5)管行苏木精伊红染色，以探讨普乐可复(FK506)对异种小肠移植排斥反应的有效抑制方法。
材料与方法一、材料选用体重110～130g的叙利亚仓鼠为供体，250～300gWister(RT11)雄性大鼠为受体(均为哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心提供)。供、受体于术前禁食约8h，饮水不限制，行仓鼠．大鼠全小肠原位移植术。
二、方法
1．分组：分为对照组(6只大鼠)和治疗组。治疗组又分为治疗1组(6只大鼠)：予以FK5062mg‘kg·d；治疗2组(6只大鼠)：予以普乐可复(FK506) 2mg‘kg·d加脾切除。
2．普乐可复(FK506)使用方法：FK506按2mg／kg稀释为0．5ml于移植前1h、移植后1—10d每日1次，肌肉注射；以后每隔2d注射1次至移植后60d止。术后5d内，肌注头孢唑啉80mg·kg·d～。
3．标本采取方法：术后1d、以后每隔5d称体重、测FK506血药浓度、检测血糖吸收值和取移植小肠标本行苏木精．伊红染色、光镜检查。
4．测量血糖吸收值方法：在乙醚麻醉下，开腹用两个血管钳钳夹移植肠管空肠起始部10cm，肠腔内注入麦芽糖1ml，30min后，从静脉吻合口近心侧受体静脉采血0．3ml，测量注入麦芽糖前、后的血糖值，切除移植小肠5cm做病理检查，然后行小肠端端吻合术，闭腹。不要求无菌操作。
三、统计学分析
数据以±s表示。采用SPSS11．0软件行KruskalWallis检验对各组生存时间进行统计学处理。
结果
一、生存时间
两个治疗组的生存时间与对照组相比，差异有非常显著性意义(P<0．01)；其中治疗1组与对照组相比，P=0．003；治疗2组与对照组相比，P=0．005。两个治疗组之间的生存时间相比，差异亦有非常显著性意义(P=0．006)，见表1。
表1异种小肠移植后大鼠的生存时间
注：治疗2组1只大鼠术后死于小肠吻合口狭窄
二、体重
对照组移植后体重下降明显。治疗组移植后体重也下降，第15天达最低点，以后逐渐上升，50d左右超过移植前水平，见图1。
图l异种小肠移植后体重的变化
三、普乐可复(FK506)血药浓度
移植后第1天FK506血药浓度为13．6ng／ml，连续给药20d达30．1ng／ml，间断给药60d维持在34．2ng／ml，停药后120dFK506血药浓度下降至1．5ng／ml。
四、移植肠管血糖吸收值
治疗组移植后第1天移植肠管就具有吸收功能，第5天已超过移植前血糖吸收值，15d以后维持在移植前的3倍水平左右，见图2。对照组麦芽糖吸收实验检测不到。
五、苏木精．伊红染色
异种小肠移植后第1天可见绒毛不整、脱落、部分绒毛顶端的上皮细胞与绒毛固有层分离，以对照组为重。第4天对照组的绒毛粗大、变短、萎缩、结构消失，肠壁结构的形态破坏，并有大量炎性细胞浸润。治疗组小肠黏膜增生、显示高分泌状态，并有少量炎性细胞浸润。第30天治疗1组可见绒毛变短、萎缩、结构破坏，并有大量炎性细胞浸润。治疗2组的上皮细胞增生，黏液细胞减少，肌层增厚；第126天其小肠肌层明显增厚，有炎性细胞浸润，绒毛萎缩、坏死、脱落，黏膜下层结构欠规整，小动脉壁增厚、纤维化。
讨论
小肠黏膜对缺血缺氧十分敏感，缺血一开始就可出现明显的结构改变。大鼠经30min、狗经60min完全缺血期后，其小肠绒毛2／3上皮细胞完全脱落，但绒毛下面部分以及腺管结构仍可保持完整121。仓鼠一大鼠的异种小肠移植也不例外，我们的实验中，对照组和治疗组术后第l天的小肠组织经苏木精．伊红染色见绒毛不整、脱落、部分绒毛顶端的上皮细胞与绒毛固有层分离，以对照组为重，是缺血再灌注损伤所致。小肠黏膜也具有很强的再生潜力，可以很快从缺血性损伤中恢复过来。缺血1h的狗肠绒毛经过24h即可重新被正常的上皮细胞所覆盖，大鼠则在48—72h内黏膜恢复正常幢1。本实验中术后第4天治疗组小肠黏膜基本恢复正常，麦芽糖吸收实验迅速恢复并高于术前，说明移植肠管已经渡过了再灌注损伤期。对照组术后4d小肠淋巴结明显肿大，管壁颜色发暗，动脉搏动消失，绒毛肿胀、变短、萎缩，肠壁结构消失，有大量炎性细胞浸润。麦芽糖吸收实验检测不到，是排斥反应所致。体液免疫在异种移植排斥反应中起重要作用，脾和小肠有大量的淋巴细胞，主要为B淋巴细胞。因此，切除了受体的小肠和脾脏可以大量减少受体内的B淋巴细胞，而这些B淋巴细胞可以产生抗异种小肠的抗体。所以，切除脾脏对异种小肠移植有用。而且普乐可复(FK506)也可抑制抗体的产生。Lin等也报道，在异种移植中，脾切除加用环磷酰胺可以明显延迟抗体的形成。
Diao等报道，在仓鼠对大鼠的异种肝移植时，独立地切脾无法延长异种移植物的生存时间，但是脾切结合CsA可以明显抑制急性排斥反应的程度。我们也曾经报道过短期应用大量FK506和切除脾脏可明显延长异种小肠移植的存活时间I51~Pierson等‘6报道，异种移植中T细胞对异种移植物的排斥反应作用机制与同种排斥反应相类似，但比同种排斥反应强烈的多。在体外实验中，人体T细胞通过两种途径识别猪的异种抗原，首先通过猪抗原呈递细胞有效地激活人细胞，使之发生直接的异种排斥反应；另外，大量猪的抗原被受体的MHC一Ⅱ分子限制性T细胞所识别，导致强烈的间接异种排斥反应，在异种移植后1周内受体就可产生强烈的直接和间接异种排斥反应，在这个过程中CD4T细胞起了很重要的作用。Hancock等在异种心脏移植的光镜检查中发现，浸润心肌的细胞为巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK)。
我们曾经报道过，普乐可复(FK506) 1mg加脾切除组的生存时间比对照组有所延长，但明显低于FK5062mg加脾切除组，因此，单纯脾切除不能明显延长异种小肠移植的生存时间。本实验中，FK5062mg加脾切组移植小肠最长存活126d。推测普乐可复(FK506)通过抑制IL-2及INF-y释放，而抑制CIMT细胞和巨噬细胞、NK细胞等的作用，与切脾共同减少了受体B细胞总数所致。而单纯使用FK5062mg组虽然生存时间比对照组延长，但远远少于FK5062mg加脾切组。FK506血药浓度于移植后20d达30．1ng／ml，间断给药60d维持在34．2ng／ml水平左右，停药后60d下降至1．5ng／ml。说明隔日应用FK506也可使血药浓度达到有效水平。血药浓度下降至敏感度以下发生了慢性排斥反应，继续应用FK5062mg·kg·d～，连续1周未见好转。说明普乐可复(FK506)不能逆转异种小肠移植后的慢性排斥反应。移植后持续应用FK506是否能发生慢性排斥反应，有待进一步研究。
仓鼠-大鼠移植动物实验模型不发生超急排斥反应，发生迟发异种移植物排斥反应和细胞介导的异种移植物排斥反应161。仓鼠一大鼠的异种小肠动物移植实验模型由我们率先报道b，而且世界上开展很少。FK506对于异种移植中NK细胞及细胞因子的作用，是我们下一步研究的内容之一。
综上所述，普乐可复(FK506)可抑制异种小肠移植后迟发异种移植物排斥反应和细胞介导的异种移植物排斥反应；大量、短期应用免疫抑制剂普乐可复(FK506)加脾切除，可明显延长异种小肠移植的存活时间，但是普乐可复(FK506)不能逆转异种小肠移植后所发生的慢性排斥反应。
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